Glyburide ( glibenclamid ) - metformin 73

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A Novel Extractionless HPLC-Fluoreszenz-Methode zur Bestimmung von Glyburide im Humanplasma: Anwendung auf einer Bioäquivalenz-Studie Jayantilal Khatri 1. Sami Qassim, Omar Abed, Boby Abraham, Ali Al-Lami, Syed Masood, Tabuk Pharmaceutical Manufacturing Co. Tabuk, Königreich Saudi-Arabien. Empfangene 12. Juni 2001, den 19. Juli Revised 2001 akzeptierte 20. Juli 2001 Zweck. Um eine einfache, empfindliche und schnelle HPLC Fluoreszenzverfahren mit Einzelschritt Probenvorbereitung zur Bestimmung von Glyburid im menschlichen Plasma zu entwickeln. Methods. Glyburide und Ketoconazol (interner Standard) wurden aus dem 0,5 ml Plasma, das durch Zugabe von 0,5 mL Acetonitril und 50 m L CuSO 4 - Lösung (5% w / v in Wasser) extrahiert. Die Trennung auf der Kingsorb 3 mm, C8-Umkehrphasensäule bei Umgebungstemperatur mit einer mobilen Phase bestand aus 45% Pufferlösung (0,05 M NH 4 H 2 P 4), 40% Acetonitril und 15% Methanol auf pH 5,7 erreicht wurde durch verdünnte Ammoniaklösung. Ein Fluoreszenz-Detektor wurde bei 235 nm Anregungswellenlänge und 354 nm Emissionswellenlängen zu überwachen eluierten Komponenten eingestellt. Ergebnisse . Der interne Standard und Glyburid bei etwa 6,7 ​​und 9,6 min eluierte, jeweils mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. Die Regressionsgleichung wurde für jede Kalibrierungskurven (5 ng / ml bis 400 ng / ml) festgestellt, die in dem Korrelationskoeffizienten von 0,99 oder mehr resultiert. Die absolute Erholung reichte von 94,32 bis 98,12% und die relative Erholung reichte von 91,12 bis 97,15%. Die Intraday-Variationskoeffizient (CV) lag im Bereich von von 6,52 bis 12,35% und interday variiert von 6,21 bis 16,07%. Die Nachweisgrenze (LOQ) von Glibenclamid wurde zu fünf ng / ml eingestellt. Schlussfolgerung . Diese einfache, schnelle und empfindliche Methode ist für pharmakokinetische, Bioverfügbarkeit und biequivalence Studien geeignet. Einführung Der Sulfonylharnstoff hypoglykämische Mittel Glibenclamid (Figur 1) auch als Glibenclamid in British Pharmacopoeia bezeichnet in der Behandlung von Typ 2 Diabetes mellitus verwendet. Die übliche Anfangsdosis für dieses hochwirksamen Medikament 2,5 bis 5 mg täglich als Einzeldosis gegeben kurz vor dem Frühstück (1). Wegen der relativ längeren Wirkungsdauer und Episoden von Hypoglykämie mit der Behandlung verbunden sind, ist es wesentlich, die Bioverfügbarkeit von Glibenclamid (2) zu überwachen. Mehrere Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie chromatographische Methoden mit UV - oder Fluoreszenzdetektor wurde für die Bestimmung von Glyburid in Körperflüssigkeiten (3-13) entwickelt. Die meisten Verfahren werden unter Verwendung von Flüssig-Flüssig-Extraktion oder Festphasenextraktion von Drogen. Alle diese Methoden erfordern eine lange Probenverarbeitung und sind zeitaufwendig. Abbildung 1. Chemische Struktur von Glibenclamid und Ketoconazol (IS) Materialen und Methoden Materialien Der Master-Referenzstandard von Glibenclamid und Ketoconazol wurde von USP (USP, 12601 Twinbrook Parkway, Rockwille, MD 20852, USA) erworben. Anschließend wurde gegen die Standard-Master-Referenz ausgewertet pharmazeutischer Qualität Rohstoff von Glibenclamid und Ketoconazol und als Referenzstandards berücksichtigt. Alle anderen Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität (E. Merck, Darmstadt, Deutschland). Die verwendeten Lösungsmittel waren von HPLC-Qualität gekauft von Carlo-Erba, Mailand, Italien. Das entionisierte Wasser wurde hergestellt Milli-Q-System (Millipore, Molsheim, Frankreich) HPLC-Bedingungen Das chromatographische System wurde bei 235 nm und 354 nm einer Lösungsmittelförderpumpe (Modell 600), ein Auto-Injektor (Modell 717), ein Scan-Fluoreszenz-Detektor (Modell 474) mit Anregungs - und Emissionswellenlängen gesetzt zusammengesetzt sind; alle von Waters Associates (Milford, MA, U. S.A.). Ein 15 cm x 4,6 mm i. d. Kingsorb C8 analytische Säule mit 3 m m Partikelgröße gepackt und eine Vorsäule Einleger mit C8 (Phenomenex, Torrance, CA, USA) für die Trennung verwendet wurden. Die mobile Phase bestand aus 45% Pufferlösung (0,05 M NH 4 H 2 PO 4), 40% Acetonitril und 15% Methanol auf pH 5,7 mit verdünnter Ammoniaklösung eingestellt wurde, mit 1 ml / min Flussrate gepumpt. Die mobile Phase wurde täglich hergestellt, gefiltert durch 0,45 m m Nylonmembranfilter (Whatman, Maidstone, England) und vor der Verwendung entgast. Die Chromatogramme wurden aufgenommen und analysiert unter Verwendung von EZ-Chrom-Chromatographie-Datensystem (Shimadzu, Columbia, MD, USA). Alle Arbeiten wurden bei 22 C Laboratoriumstemperatur durchgeführt. Stammlösungen Exakt 50 mg Glibenclamid Referenzstandard gewogen wurde in Acetonitril auf 200 ml gelöst und verdünnt in einer Konzentration von 250 m g / ml Primärstandard zu geben. Anschließende Verdünnungen wurden zu geben gemacht 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 4 und 8 m g / ml-Stammlösungen für die Eichkurve und 0,3, 1,5 und 6 m g / ml-Stammlösungen für die Validierungsproben. Der primäre Standard von Ketoconazol (IS) bei 1 mg wurde hergestellt / ml durch Auflösen genau gewogen 100 mg Ketoconazol Referenzstandard auf 100 ml in Acetonitril. Eine weitere Verdünnung wurde gemacht, um Stammlösung des internen Standards bei der Konzentration von sechs m g / ml erhalten. Primäre Standards und Stammlösungen wurden einmal wöchentlich vorbereitet. Alle Lösungen wurden bei (8 bis 12 C) gelagert. Kalibrierproben In einer Serie von 12 ml, versiegelt PTFE Glasröhrchen 0,5 ml blank Plasma und 25 m L von 6 mg / ml Ketoconazol (interner Standard) wurden zugegeben, mit 25 m L Stammlösung geeigneter Konzentration enthält Kalibrierungsproben von 5, 10 zur Verfügung zu stellen , 25, 50, 100, 200 und 400 ng / mL. Nach einer kurzen Wirbel 50 m l CuSO 4 (5% ige Lösung in Wasser) und 500 m L Acetonitril gegeben Proteine ​​auszufällen wurden vermischt werden. Jede Kalibrierungsprobe wurde dann Vortex-gemischt und für 15 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde in ein Autosampler Fläschchen überführt (1 mL Fassungsvermögen) und 25 m L Aliquot wurde in die HPLC-Säule injiziert. Die Plasmaproben Die Proben aus dem Subjekt erhalten wurden, ähnlich wie Eichprobe verarbeitet, wie erwähnt unter Kalibrierproben der Ausnahme, dass 25 m L Acetonitril anstelle von 25 m L Stammlösung hinzugefügt wurde. Pharmacokinetics Das Studienprotokoll wurde von der Internen Review Board im Prince Fahd Bin Sultan Hospital, Tabuk, Saudi-Arabien genehmigt. Zwanzig sechs gesunden teilgenommen männlichen Probanden in einer einzigen Dosis Fasten Crossover Bioäquivalenz-Studie. Nach informierte Einwilligung jeder Proband erhielt 5 mg Glibenclamid Tablette entweder der Testformulierung (Gliburan, Chargen-Nr. PD27, hergestellt von Tabuk Pharmaceutical Mfg. Co. Saudi-Arabien) oder Referenzformulierung (Daonil, Chargen-Nr. 41C224, hergestellt von Hoechst AG, Deutschland ). Blutproben (6 ml) wurden in heparinisierte Röhrchen bei predose gesammelt und 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12,0, 16,0 und 24 h nach der oralen Verabreichung des Arzneimittels. Plasma wurde sofort durch Zentrifugation und gelagert bei -50 C in 5 ml-Polypropylenröhrchen bis zur Analyse abgetrennt. Ergebnisse und Diskussionen Die mobile Phase für den Assay verwendet bereitgestellt eine gut definierte Trennung zwischen dem Medikament, interner Standard und endogene Komponenten (Abbildung 2). Die optimale Fließgeschwindigkeit für die mobile Phase (1 ml / min) ergab eine Analysenzeit von weniger als 15 min / Probe. Mögliche Störungen von anderen Drogen wurde durch die Untersuchung ihrer Spitze Trennung von Glibenclamid unter Verwendung der gleichen HPLC-Bedingungen untersucht. Alle untersuchten OTC-Arzneimittel einschließlich Paracetamol, Koffein, Aspirin und Ibuprofen zeigte keine Interferenz in dem Test. Die Retentionszeiten für Ketoconazol (interner Standard) und Glibenclamid waren 6,7 und 9,6 Minuten. Die Stunde Null (predose) Proben aller Probanden zeigten keine Interferenz bei einer Retentionszeit der beiden Medikamente. Die mögliche Interferenz von den Metaboliten (cis-3-hydroxyglyburide und trans-4-hydroxyglyburide) wurde durch Ausführen einer Reihe von Proben aus einem ohne Zusatz von internen Standards bewertet, die klare Grundlinie um die Retentionszeit des internen Standards gab. Theoretisch sind Hydroxymetaboliten relativ polarer als Muttersubstanz und sie sollten vor dem Gipfel von Glibenclamid in Umkehrphasenchromatographie System ausströmen. Abbildung 2. Repräsentative Chromatogramme: A) blank pasma, B) Plasma versetzt mit 150 ng / mL Ketoconazol (IS) und 100 ng / ml Glibenclamid und, C) Plasmaprobe von einem Subjekt 2 h nach der Verabreichung von 5 mg Glibenclamid-Tablette, die Konzentration von Glibenclamid ist 51,7 ng / mL. Die Quantifizierung des Chromatogramms wurde mit Peakflächenverhältnisse des Arzneimittels zu internen Standard durchgeführt. Die Eichkurven wurden routinemäßig für spiked Plasma, enthaltend 5 ng / ml, 10 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml, 200 ng / mL und 400 ng / ml Glyburid während des Prozesses der konstruiert Vorstudie Validierung und in-Studie Validierung. Least Squares lineare Regressionsanalyse der Kalibrierungskurven ergaben sich folgende Gleichungen: Y = 0.0063X + 0,0374, R 2 = 0,998. Standardkurven von Glibenclamid im Plasma wurden an elf verschiedenen Tagen über einen 4 Wochen Zeit konstruiert, um die Variabilität der Steigungen und Schnittpunkte zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten wenig interday Variabilität von Steigungen und Schnittpunkte, sowie eine gute Linearität (r 2 0,99) über den Konzentrationsbereich untersucht. Der Koeffizient von Variationen für die Piste war 6,58%, was eine gute Genauigkeit des Verfahrens angibt. Die niedrigste Standard auf der Eichkurve war fünf ng / ml und wurde als Bestimmungsgrenze auf der Grundlage von weniger als 20% CV als Akzeptanzkriterien akzeptiert. unter Verwendung von sechs wiederholten Bestimmungen für drei Gelegenheiten Die Intraday-Präzision wurde durch Analyse von Plasmaproben mit Glibenclamid bei drei verschiedenen Konzentrationen das heißt 5 ng / ml, 75 ng / ml und 300 ng / ml bewertet. Die untertägige Präzision zeigte einen Variationskoeffizienten (CV) von 6,52 bis 12,35% (Tabelle 1). Die interday Präzision wurde in ähnlicher Weise bewertet über zwei Wochen und einen Lebenslauf zeigte 6,21-16,07% variiert (Tabelle 1). Tabelle 1: Präzision und Genauigkeit der Qualitätskontrollproben Tabelle 2. Gewinnung von Glibenclamid und Ketoconazol (IS) in menschlichem Plasma Die Werte in Klammern sind% CV Die Stabilitätsstudien von Plasmaproben aufgestockt mit Glyburid (5 ng / ml, 75 ng / mL und 300 ng / ml) wurden über vier Wochen (Tabelle 3) durchgeführt. Darüber hinaus Stabilitätsstudien von Plasmaproben gespickt mit Glibenclamid für 24 Stunden bei Raumtemperatur Lagerung durchgeführt wurden, und für drei Gefrier-Auftau-Zyklen. Die Plasmaproben wurden in der Tiefkühltruhe bei -50 C bis zum Zeitpunkt der Analyse gelagert. Die Ergebnisse zeigen, dass Glibenclamid in dem Plasma für einen Monat ohne Abbau gefroren gelagert werden kann. Die Ergebnisse der Kurzzeitlagerung bei Raumtemperatur, die Lösungsstabilität und Gefrier-Auftau-Zyklen zeigte keinen Abbau von Glyburid im Plasma als auch in Lösung könnte daher Proben ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden. Tabelle 3. Stabilität von Glibenclamid in menschlichem Plasma während der Lagerung und Handhabung von Proben Die Bioäquivalenz von zwei Glibenclamid Produkte, Referenz und allgemeine Formulierung wurde in 26 gesunden männlichen Probanden verglichen, die eine einzige 5 mg orale Dosis in Crossover-Design erhalten. Wie in (3), die generische Menge gezeigt, dass ein großer Unterschied in der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu dem Referenzprodukt zeigte. Die Peak-Plasmaspiegel waren signifikant höher für Testprodukt als Referenz. Abbildung 3. Mittlere Konzentrations-Zeit-Profile von 5 mg Glibenclamid nach der Verabreichung von Test - und Referenz Tablette zu 26 gesunden Probanden, Fehlerbalken stellen + SD. Die 90% Vertrauensintervalle von T / R-Verhältnis des C max. AUC 0-24. AUC 0- Ґ. out waren Seite der Bioäquivalenz akzeptablen Bereich von 80 bis 125% und damit zwei Produkte wurden geschlossen bioinequivalent (Tabelle 4). Die pharmakokinetischen Parameter und ANOVA wurde mit WinNonlin Professional-Programm (Pharsight Corporation 299 California Avenue, Palo Alto, CA 94306.) berechnet. Der Mittelwert von C max. AUC 0-24. AUC 0- Ґ. T max. K e. T 1/2 für Testprodukt war 175,9 ng / ml, 782,6 ng · h / ml, 870,4 ng · h / ml, 3,25 h, 0,4387 h -1. 2.49 h und als Referenz war 107,9 ng / ml, 543,3 ng · h / ml, 622,3 ng · h / ml, 0,4098 h -1. 2,93 h, respectively. Tabelle 4. Bioäquivalenz Statistiken (zwei, One-Sided T-Tests) Schlussfolgerungen Diese einfache, schnelle und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Verfahren mit Schritt Probenvorbereitung validiert ermöglicht mindestens 60 Proben pro Tag zu verarbeiten. Das Verfahren wird auf etwa 700 Proben für eine Bioäquivalenz-Studie gesammelt erfolgreich angewendet. Die Stabilität Ergebnisse zeigten, dass Glibenclamid und IS sind recht stabil im Plasma und in den Lösungen daher keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen bei der Probenaufbereitung und Lagerung benötigt werden. Wegen der hohen Empfindlichkeit und 0,5 ml Probe Anforderung kann dieses Verfahren in Pharmakokinetik verwendet werden, die Bioverfügbarkeit und die Bioäquivalenz Studien. Anerkennungen Wir wünschen Dr. Zaid Salhab von Prinz Fahd Bin Sultan Krankenhaus für seine Führung in die Einleitung Normen der Good Clinical Practice, vor allem die ethischen Fragen und Dokumentation beteiligt bei der Durchführung von Bioäquivalenzstudien danken. Referenzen Kathleen P. Martindale. Die pharmazeutische Presse, London, UK, 1999. Ferner RE, Neil HAW. Sulfonylharnstoffe und Hypoglykämie. Br Med J 1988; 296: 949-950. Al-Dhawailie AA, Abdulaziz MA, Tekle A, Matar KM. Eine einfache, spezifisch und schnelle Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Assays für Glibenclamid in Plasma. J Liq Chromatogr 1995; 18: 3981-3990. Arcelloni C, Fermo I, Calderara A, Pacchioni M, Pontiroli AE, Paroni R. Glibenclamid und Tolbutamid in menschlichem Serum: Schnelle Messung von freien Fraktion. J Liq Chromatogr 1990; 13: 175-189. Shenfield GM, Boutagy JS, Webb CA. Screening-Test für Sulfonylharnstoffe in Plasma zu erfassen. Ther Drug Monit 1990; 12: 393-397. Starkey BJ, Mould GP, Teale JD. 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